Использование радиоизотопных методов и идентификация промежуточных продуктов обычно позволяют определить последовательность реакций, приводящих к. синтезу антибиотика. Эту последовательность, однако, нельзя считать окончательно установленной до тех пор, пока не показано, что микроорганизм обладает ферментами, способными катализировать отдельные реакции последовательности. Этот вопрос изучают с помощью обычных биохимических методов. Исследуют ферментативную активность бесклеточных систем, по возможности фермент очищают и определяют его свойства. При образовании семейств антибиотиков бывает целесообразно определить субстратную специфичность фермента. Для подтверждения роли фермента часто устанавливают его наличие и отсутствие у образующих и не образующих антибиотика вариантов микроорганизма. Очевидно, что описанный здесь ход исследований является некой идеализацией. На самом деле ключом к установлению пути биосинтеза может оказаться идентификация определенной ферментативной активности еще до того, как получены какие-либо промежуточные продукты. Часто промежуточные продукты очень легко выделяются из штаммов, полученных в результате обработки продуцентов мутагенами с целью повышения их активности. Однако все сложные биосинтетические пути, установленные в последние годы, были идентифицированы в результате комбинированного использования всех методов, представленных выше.